Praktikum Kimpang Protein_yoechan_

V.        PEMBAHASAN

Protein adalah senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi yang merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida. Molekul protein mengandung karbon, hidrogen, oksigen, nitrogen dan kadang kala sulfur serta fosfor. Protein berperan penting dalam struktur dan fungsi semua sel makhluk hidup dan virus.

Kebanyakan protein merupakan enzim atau subunit enzim. Jenis protein lain berperan dalam fungsi struktural atau mekanis, seperti misalnya protein yang membentuk batang dan sendi sitoskeleton. Protein terlibat dalam sistem kekebalan (imun) sebagai antibodi, sistem kendali dalam bentuk hormon, sebagai komponen penyimpanan (dalam biji) dan juga dalam transportasi hara. Sebagai salah satu sumber gizi, protein berperan sebagai sumber asam amino bagi organisme yang tidak mampu membentuk asam amino tersebut (heterotrof).

Struktur protein, yaitu berupa struktur primer (tingkat satu), sekunder (tingkat dua), tersier (tingkat tiga), dan kuartener (tingkat empat):

a)      Struktur primer protein merupakan urutan asam amino penyusun protein yang dihubungkan melalui ikatan peptida (amida). Urutan asam amino menentukan fungsi protein. Translokasi asam amino akan mengubah fungsi protein, dan lebih lanjut memicu mutasi genetik.

b)      Struktur sekunder protein adalah struktur tiga dimensi lokal dari berbagai rangkaian asam amino pada protein yang distabilkan oleh ikatan hidrogen. Berbagai bentuk struktur sekunder misalnya ialah sebagai berikut:

• alpha helix (α-helix, "puntiran-alfa"), berupa pilinan rantai asam-asam amino berbentuk seperti spiral;
• beta-sheet (β-sheet, "lempeng-beta"), berupa lembaran-lembaran lebar yang tersusun dari sejumlah rantai asam amino yang saling terikat melalui ikatan hidrogen atau ikatan tiol (S-H);
• beta-turn, (β-turn, "lekukan-beta"); dan
• gamma-turn, (γ-turn, "lekukan-gamma").

c)      Struktur tersier yang merupakan gabungan dari aneka ragam dari struktur sekunder. Struktur tersier biasanya berupa gumpalan. Beberapa molekul protein dapat berinteraksi secara fisik tanpa ikatan kovalen membentuk oligomer yang stabil (misalnya dimer, trimer, atau kuartomer) dan membentuk struktur kuartener. Contoh struktur kuartener yang terkenal adalah enzim Rubisco dan insulin.

Struktur protein lainnya yang juga dikenal adalah domain. Struktur ini terdiri dari 40-350 asam amino. Protein sederhana umumnya hanya memiliki satu domain. Pada protein yang lebih kompleks, ada beberapa domain yang terlibat di dalamnya. Hubungan rantai polipeptida yang berperan di dalamnya akan menimbulkan sebuah fungsi baru berbeda dengan komponen penyusunnya. Bila struktur domain pada struktur kompleks ini berpisah, maka fungsi biologis masing-masing komponen domain penyusunnya tidak hilang. Inilah yang membedakan struktur domain dengan struktur kuartener. Pada struktur kuartener, setelah struktur kompleksnya berpisah, protein tersebut tidak fungsional.

Tabel 6.1. Hasil Pengamatan Reaksi Biuret

Kel	Sampel	Warna Setelah (+) NaOH	Warna Setelah (+) tetes CuSO4	Warna Setelah 10 tetes CuSO4	Simpulan
9	Albumin	Putih gading / kekuningan	Ungu membayangan di bagian atas	Ungu muda (merata)	Positif (+)
13	Urea	Putih menggumpal	Tidak ada Perubahan	Tidak ada Perubahan	Negatif (-)

A.  Reaksi Pewarnaan

1. Reaksi biuret

Biuret adalah senyawa dengan dua ikatan peptida yang terbentuk pada pemanasan dua mulekul urea. Ion Cu²⁺ dari pereaksi Biuret dalam suasana basa akan bereaksi dengan polipeptida atau ikatan-ikatan peptida yang menyusun protein membentuk senyawa kompleks berwarna ungu atau violet. Reaksi ini positif terhadap dua buah ikatan peptida atau lebih, tetapi negatif untuk asam amino bebas atau dipeptida.

Polipeptida mempunyai perbedaan dengan protein. Polipeptida mempunyai residu asam amino ≤ 100 dan dan bobot mulekul ≤ 6.000. Sedangkan, pada protein residu asam amnionya ≥ 100 dan bobot mulekulnya ≥ 6.000. Pada percobaan, dapat dilihat bahwa urea dan albumin diteteskan larutan NaOH 10% dan larutan CuSO₄. Fungsi dari penambahan larutan NaOH adalah agar suspensi protein menjadi bersuasana alkalis. Sedangkan penambahan larutan CuSO₄ berfungsi untuk menghasilkan biuret yang berwarna ungu, berdasarkan hasil percobaan didapatkan bahwa zat uji Albumin memiliki rumus bangun yang lebih kompleks dan mengikat dua atau lebih asam amino esensial, sehingga terbentuk ikatan peptida. Semakin banyak ikatan peptida yang dimiliki, maka warna ungu akan tampak semakin nyata.

Sebagai perbandingan, urea yang dipanaskan telah dicampur NaOH kemudian ditetesi CuSO₄ berbau sulfur, dan tidak mengalami perubahan dari putih menggumpal. Hal ini membuktikan bahwa urea memiliki sedikit ikatan peptida lebih sedikit dibandingkan dengan albumin, dan juga mengandung sulfur. Jika urea mengandung sulfur, maka urea termasuk molekul protein, karena sulfur merupakan molekul protein. Jadi, ikatan peptida hanya terbentuk apabila ada dua atau lebih asam amino esensial yang bereaksi.

Tabel 6.2. Hasil Pengamatan Reaksi Ninhidrin

Kel	Sampel	Ditambahkan Larutan Ninhidrin	Setelah di Panaskan	Kesimpulan
10	Albumin	Terdapat endapan putih di bagian atas	Bagian bawah terdapat endapan putih Bagian atas larutan berwarna ungu pucat	(+)
14	Urea	Larutan berwarna putih susu (tidak merata)	Larutan berwarna putih susu pekat (merata) dan terbentuk endapan putih	(-)

Reaksi Ninhidrin (triketohidrien hidrat) suatu senyawa oksidator kuat ang bereaksi dengan asam α amino pada pH 4-8 dan dihasilkan senyawa yang berwarna ungu. Reaksi juga dapat terjadi dengan senyawa amin primer dan amonia tanpa pembebasan CO. Asam-asam prolin dan hidroksida prolin juga bereaksi dengan ninhidrin, akan tetapi hasil warna yang diperoleh adalah warna kuning bukan ungu seperti pada asam amino. Asam amino bebas adalah asam amino dimana gugus aminonya tidak terikat. Pada praktikum di atas, sampel albumin membentuk warna ungu pucat dengan endapan putih, karena dapat bereaksi dengan Ninhidrin. Hal ini menandakan albumin mempunyai gugus asam amino bebas.

Sebaliknya, pada urea tidak diperoleh indikasi terbentuk atau adanya asam amino bebas, karena reaksi dengan ninhidrin tidak berwarna sampai membentuk warna putih dan endapan putih. Semakin banyak ninhidrin pada zat uji yang dapat bereaksi, semakin pekat warnanya. Hal ini juga mendasari bahwa uji Ninhidrin dapat digunakan untuk menentukan asam amino secara kuantitatif.

B. Sifat Koagulasi Protein

Table 6.3. Hasil Pengamatan Pembentukan Endapan dengan Asam dan Alkali

Kelompok	Sampel	Setelah koagulan	Setelah didiamkan	Setelah dipanaskan
albumin	NaOH 40%	Endapan bergelembung	Gelembung berkurang, kuning bening, tidak ada endapan	Gelembung +
	HCl pekat	Putih pekat, mengendap	Endapan makin pekat	2 fase
	Asam asetat glasial	Putih ada endapan melayang	Putih ++ endapan melayang	Koloid putih ++++
gelatin	NaOH 40%	Larutan kuning endapan putih	Larutan kuning keruh	Larutan kuning
	HCl pekat	Larutan putih ada endapan	Endapan putih	Keruh ++++
	Asam asetat glasial	Keruh dan bening (2 fase)	Keruh ++ tidak ada endapan	Tidak ada endapan

Albumin adalah protein yang dapat larut dalam air serta dapat terkoagulasi oleh panas. Albumin terdapat dalam serum darah dan putih telur (Poedjiadi, 1994). Pengendapan protein dapat dilakukan dengan cara penambahan asam, alkali, dan juga dengan cara penambahan garam dari logam berat. Pada uji koagulasi protein, endapan albumin yang terjadi setelah penambahan asam asetat, hal tersebut juga terjadi dengan penambahan NaOH 40% dan HCl pekat. Setelah didiamkan beberapa menit albumin ditambah NaOH 40% tidak terdapat endapan sedangkan pada albumin ditambahkan HCl pekat semakin pekat endapannya, dan endapan albumin ditambah asam asetat glasial semakin banyak endapan yang terbentuk.

Pada sampel gelatin yang ditambahkan NaOh 40% dan HCl pekat yang membentuk endapan, sedangkan penambahan asam asetat glasial tidak terbentuk endapan. Hingga didiamkan dan dipanaskan gelatin yang diberi penambahan asam asetat glasial tidak terbentuk endapan. Hal ini menunjukkan bahwa endapan tersebut masih bersifat sebagai protein, hanya saja telah terjadi perrubahan struktur tersier ataupun kwartener, sehingga protein tersebut mengendap. Perubahan struktur tesier albumin ini tidak dapat diubah kembali ke bentuk semula, ini bisa dilihat dari tidak larutnya endapan albumin itu dalam air.

Tabel 6.4. Hasil Pengamatan Pembentukan Endapan dengan Garam dari Logam Berat

Sampel	Garam
	CuSO4 0,2 %	FeCl3 0,2%	HgCl 0,2%	PbAc 0,2%
Albumin	+	+	+	+
Gelatin	-	-	-	-

Keterangan :

(+) Ada endapan

(-) Tidak ada endapan

Protein akan mengalami presipitasi bila bereaksi dengan ion logam. Pengendapan oleh ion positif (logam) diperlukan pH larutan karena protein bermuatan negatif, pengendapan oleh ion negatif diperlukan ph larutan dibawah pi karena protein bermuatan positif. Ion-ion positif yang dapat mengendapkan protein adalah; Ag⁺, Ca²⁺, Zn²⁺, Hg²⁺, Fe²⁺, Cu²⁺ dan Pb²⁺, sedangkan ion-ion negatif yang dapat mengendapkan protein adalah: ion salisilat, triklorasetat, piktrat, tanat dan sulfosalisilat. (Anna, P., 1994).

Protein yang tercampur oleh senyawa logam berat akan terdenaturasi. Hal ini terjadi pada albumin yang terkoagulasi setelah ditambahkan masing-masing 0,2%  larutan SO₄, FeCl₃, HgCl₂ dan Pb-asetat (PbAc). Senyawa-senyawa logam tersebut akan memutuskan jembatan garam dan berikatan dengan protein membentuk endapan logam proteinat. Protein juga mengendap bila terdapat garam-garam anorganik dengan konsentrasi yang tinggi dalam larutan protein. Berbeda dengan logam berat, garam-garam anorganik mengendapkan protein karena kemampuan ion garam terhidrasi sehingga berkompetisi dengan protein untuk mengikat air. Sedangkan sampel gelatin diberi penambahan masing-masing 0,2%  larutan SO₄, FeCl₃, HgCl₂ dan Pb-asetat (PbAc) tidak menunjukkan endapan.

C. Denaturasi dan Koagulasi

Tabel 6.5. Hasil Pengamatan Denaturasi dan Koagulasi

pH	Menit	Setelah dikocok	Setelah dipanaskan
3,8	0‘	Keruh (++++) Endapan (-)	Tetap Keruh
	5‘	Keruh (++++) Endapan (-)
	10‘	Putih keruh Endapan (-)
	15‘	Keruh
4,7	0‘	Keruh (+++) Endapan (-)	Bening, endapan berkurang dan menggumpal
	5‘	Keruh (+++)
	10‘	Tidak berwarna Endapan putih (+)
	15‘	Bening Endapan (+++)
5,0	0‘	Keruh (++) Endapan (-)	Bening, endapan berkurang dan menggumpal
	5‘	Keruh (++)
	10‘	Tidak Berwarna Endapan putih (+)
	15‘	Bening Endapan Putih (++)
5,3	0‘	Keruh (+) Endapan (-)	Bening dan tidak terdapat endapan
	5‘	Keruh (+)
	10‘	Tidak Berwarna Endapan (-)
	15‘	Bening

Pada denaturasi terjadi pemtusan ikatan hidrogen, interaksi hidrofobik, dan ikatan garam hingga molekul protein tidak punya lipatan lagi. Protein akan mengalami koagulasi apabila dipanaskan pada suhu 50^oC atau lebih. Koagulasi ini hanya terjadi bila larutan protein berada titik isolistriknya (Poedjiadi, 1994). Pada pH iso-elektrik (pH larutan tertentu biasanya berkisar 4 –4,5 di mana protein mempunyai muatan positif dan negatif sama, sehingga saling menetralkan) kelarutan protein sangat menurun atau mengendap, dalam hal ini pH isolistrik albumin adalah 4,55 - 4,90. Pada temperatur di atas 60^oC kelarutan protein akan berkurang (koagulasi) karena pada temperatur yang tinggi energi kinetik molekul protein meningkat sehingga terjadi getaran yang cukup kuat untuk merusak ikatan atau struktur sekunder, tersier, dan kuartener yang menyebabkan koagulasi. Protein yang telah mengalami denaturasi akan memberikan beberapa hal seperti:
viskositas naik ( karena mol menjadi asimetris dan lipatan hilang) dan rotasi optis larutan protein meningkat.

Jika suatu larutan protein yaitu larutan casein 5% secara perlahan dipanaskan sampai kira-kira 60-70⁰C dan jika ditetesi buffer berbagai pH selama 0-30 menit, larutan tersebut lambat laun akan menjadi keruh dan membentuk koagulasi berbentuk seperti tali. Produk yang telah terkoagulasi tidak akan terlarut lagi dengan pendinginan dan tidak dapat membentuk larutan jernih kembali seperti semula karena perlakuan pemanasan telah mengubah sifat-sifatnya secara tidak dapat balik. Pengaruh panas terjadi pada semua protein globular tanpa memandang ukuran atau fungsi biologinya, walaupun suhu yang tepat bagi peristiwa ini mungkin bervariasi.

Larutan buffer pH 3,8 tidak terdapat endapan yang terbentuk selama 15 menit dan larutan keruh. Larutan buffer pH 4,7 sampai menit ke-5 belum terbentuk endapan dan larutan keruh dan terbentuk endapan pada menit ke-10 dengan larutan bening, setelah dipanaskan larutan menjadi bening, endapan berkurang, dan menggumpal. Larutan buffer pH 5,0 sampai menit ke-5 belum terbentuk endapan dan larutan keruh dan terbentuk endapan pada menit ke-10 dengan larutan bening, setelah dipanaskan larutan menjadi bening, endapan berkurang, dan menggumpal. Larutan buffer pH 5.3 sampai menit ke-15 tidak terbentuk endapan dan dengan dipanaskan larutan menjadi bening dan tidak terdapat endapan

D. Titik Isoelektris

Tabel 6.6. Hasil Pengamatn Titik Isoelktrik

sampel	Waktu	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
albumin	10’	bening	bening	bening	bening	bening	bening	bening	bening	bening	bening
	20’	bening	bening	bening	bening	bening	bening	bening	bening	bening	bening
casein	10’	Bening ++ Tidak ada endapan	Bening Tidak ada endapan	Keruh +++++	Bening Ada endapan	Keruh ++++ Ada endapan	Keruh +++ tidak ada endapan	Keruh +++	Keruh +++++	Bening ++ tidak ada endapan	Bening + tidak ada endapan
	20’	Tidak ada perubahan	Tidak ada perubahan	Tidak ada perubahan	Tidak ada perubahan	Tidak ada perubahan	Tidak ada perubahan	Ada 2 fase	Tidak ada perubahan	Tidak ada perubahan	Tidak ada perubahan

Titik Isoelektrik adalah derajat keasaman atau pH ketika suatu makromolekul bermuatan nol akibat bertambahnya proton atau kehilangan muatan oleh reaksi asam-basa. Pada koloid, jika pH sama dengan titik isoelektrik, maka sebagian atau semua muatan pada partikelnya akan hilang selama proses ionisasi terjadi. Jika pH berada pada kondisi di bawah titik isoelektrik, maka matan partikel koloid akan bermuatan positif. Sebaliknya jika pH berada di atas titik isoelektrik maka muatan koloid akan berubah menjadi netral atau bahkan menjadi negatif. Pada protein yang mengalami denaturasi proteinnya akan mengendap karena gugus-gugus bermuatan positif dan negative dalam jumlah yang sama atau netral atau dalam keadaan titk isoelektrik.

Seperti peptide sederhana, rantai polipeptida protein mempunyai titik isoelektrik yang khas, yang akan mencerminkan jumlah relatif gugus R asam dan basa. Pada setiap pH tertentu, suatu campuran protein akan mengandung beberapa gugus yang bermuatan total negatif, beberapa yang bermuatan total positif, dan beberapa tidak bermuatan. Jika campuran ini ditempatkan pada medan listrik, protein bermuatan positif akan bergerak mejuju elektroda muatan negatif dan begitu pula sebaliknya, serta protein yang tidak bermuatan akan tinggal diam.

Sampel albumin setelah 10 menit dan 20 menit pencampuran pada tabung 1 hingga 10 terbentuk larutan bening. Sampel casein setelah 10 menit pencampuran terdapat latutan yang keruh dan bening, dan pada tabung ke-4 dan ke-5 tedapat endapan yang terbentuk. Setelah 20 menit pencampuran sampel casein banyak yang tidak mengalami perubahan namun pada tabung reaksi ke-7 terbentuk 2 fase.

E. Salting Out

Tabel 6.7. Hasil Pengamatan Salting Out

Kel	Sampel Setelah 40˚C	Sampel + Garam	Sampel + Garam + NaOH	Sampel + Garam + NaOH + Biuret
9	-	-	-	-
10	-	+	++	++
11	-	-	-	-
12	-	+	-	-
13	-	+	++	++
14	-	+	++++	++++
15	-	+	+	+
16	-	+	+++	+++

Keterangan :

(+) Ada endapan putih

(-) Tidak ada perubahan (tidak ada endapan putih)

Ketika konsentrasi garam meningkat, sebagian dari molekul-molekul air akan tertarik oleh ion garam, yang kemudian akan mengurangi jumlah molekul air yang dapat berinteraksi dengan bagian hidrofobic protein. Sebagai akibat dari meningkatnya permintaan molekul solven , interaksi antar protein menjadi lebih kuat daripada interaksi antara pelarut dan zat terlarut, Hal ini akan menyebabkan molekul-molekul protein mengental dengan membentuk interaksi hidrofobik dengan satu sama lain. Proses ini dikenal sebagai salting-out. Sebagian besar protein tidak larut dalam larutan garam yang pekat. Bila dalam suatu larutan protein ditambahkan garam, maka daya larutnya akan berkurang sehingga protein tersebut akan terpisah sebagai endapan. Prinsip ini digunakan untuk memisahkan protein dari campuran dengan senyawa lain. Salting (penggaraman) out adalah metode untuk memisahkan protein berdasarkan pada prinsip bahwa protein kurang larut pada tinggi garam konsentrasi. Konsentrasi garam yang diperlukan untuk protein untuk mempercepat keluar dari solusi berbeda dari protein terhadap protein.

VII. KESIMPULAN

Berdasarkan pengamatan yang telah dilakukan dapat diambil beberapa kesimpulan diantaranya adalah :

·         Pereaksi Biuret dalam suasana basa akan bereaksi dengan polipeptida atau ikatan-ikatn peptida yang menyusun protein membentuk senyawa kompleks berwarna ungu atau violet.

·         Sampel albumin membentuk warna ungu pucat dengan endapan putih, karena dapat bereaksi dengan Ninhidrin.

·         Pengendapan protein dapat dilakukan dengan cara penambahan asam, alkali, dan juga dengan cara penambahan garam dari logam berat.

·         Denaturasi albumin tanpa penambahan alkohol, endapan yang paling banyak dihasilkan oleh buffer asetat, diikuti oleh HCl dan NaOH.

·         Penambahan bufer asetat bertujuan agar pH isolistrik tercapai, sehingga albumin dapat terdenaturasi.

·         Koagulasi adalah denaturasi protein akibat panas.

·         Adanya gugus amino dan karboksil bebas pada ujung-ujung rantai molekul protein, menyebabkan protein mempunyai banyak muatan (polielektrolit) dan bersifat amfoter (dapat bereaksi dengan asam maupun basa).

·         Garam logam berat seperti Fe, Cu, Pb, dan Hg akan membentuk endapan logam proteinat.

• Pada denaturasi terjadi pemtusan ikatan hydrogen, interaksi hidrofobik dan ikatan garam hingga molekul protein tidak punya lipatan lagi.

·         Salting (penggaraman) out adalah metode untuk memisahkan protein berdasarkan pada prinsip bahwa protein kurang larut pada tinggi garam konsentrasi.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim¹. 2007. Pengetahuan Protein. Available at : http://jlcome.blogspot.com/2007/10/ pengetahuan-protein.html (diakses pada tanggal 03 Desember 2011)

Anonim². 2010. Protein. Available at : http://id.wikipedia.org/wiki/Protein (diakses pada tanggal 03 Desember 2011).

Anonim³. 2009. Uji Kualitatif Protein dan Asam Amino. Available at : http://www.rismaka.net/2009/06/uji-kualitatif-protein-dan-asam-amino.html (diakses pada tanggal 04 Desember 2011)

Girindra, A. 1986. Biokimia I. Gramedia, Jakarta.

Lehninger, A. 1988. Dasar-dasar Biokimia. Terjemahan Maggy Thenawidjaya. Erlangga. Jakarta

Ophart, C.E., 2003. Virtual Chembook. Elmhurst College.

Poedjiadi, Anna. 1994. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta: UI Press.

Winarno, F. G., 1992. Kimia Pangan dan Gizi. Gramedia: Jakarta.

Winarno, F. G., 2002. Kimia Pangan dan Gizi. Gramedia: Jakarta